巴沙魚黃肉癥：揭開自由基損傷與巴沙魚黃肉癥的個中原因

作者 | 陶青燕

來源 | 騰氏水產(chǎn)商務(wù)網(wǎng)-當(dāng)代水產(chǎn)

無論是養(yǎng)在越南、印度尼西亞還是中國的巴沙魚都有較高比例的黃肉現(xiàn)象發(fā)生，并直接導(dǎo)致了肉品的顯著下降與經(jīng)濟(jì)損失。調(diào)查表明，相對于正常肉片，因黃色肉片而導(dǎo)致的塘口經(jīng)濟(jì)損失為10.5%，而魚片加工廠的損失則可高達(dá)到14%。

國際水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)盟（GAA）對于巴沙魚黃肉癥的表述為：黃肉癥主要發(fā)生于成年巴沙魚，主要季節(jié)為雨季。盡管至今未發(fā)現(xiàn)有任何病原與黃肉癥相關(guān)，但黃肉癥的魚通常容易感染外部寄生蟲，而且黃肉癥魚非常脆弱并易于感染細(xì)菌性疾病。黃肉癥的總體臨床癥狀有貧血，失重，腹水以及肉片發(fā)黃。從早到晚每天幾次調(diào)控水體溶氧是所有巴沙魚養(yǎng)殖池塘的例行管理方式。在雨季時高密度的巴沙魚養(yǎng)殖池塘使用各種機(jī)械式增氧機(jī)如水泵式，水車式或擴(kuò)散式增氧機(jī)可以減少該病的發(fā)生。

從這段描述中可以看到，不同于一般意義的食源性類胡蘿卜素沉著，巴沙魚黃肉癥表現(xiàn)出了明顯的病理改變。由于一直未探測到任何病原與巴沙魚黃肉癥相關(guān)，提示這很可能是一種營養(yǎng)代謝性疾病。

諾偉司對于巴沙魚黃肉癥的研究始于2010年，經(jīng)歷了巴沙魚魚片顏色經(jīng)濟(jì)性和流行性調(diào)研，魚片中類胡蘿卜素含量分析、肉色色差計分析及比色扇制作、換水模式對巴沙魚肉色的影響、高低蛋白日糧對巴沙魚肉色的影響，高米糠日糧對巴沙魚肉色的影響、氧化米糠對巴沙魚肉色的影響等系一列研究。此外，諾偉司在黃膘豬上的研究表明，脂肪酸體內(nèi)氧化形成的脂褐素是導(dǎo)致豬膘發(fā)黃的原因。隨著巴沙魚黃肉癥研究的深入開展，越來越多的證據(jù)指向體內(nèi)氧化與巴沙魚黃肉癥之間的因果關(guān)系。

樣品采集

我們從湛江地區(qū)采集了具有典型黃肉特征的巴沙魚樣品，收集肝臟組織、脂肪組織和肌肉組織進(jìn)行病理學(xué)研究。通過HE染色進(jìn)行各組織器官的形態(tài)學(xué)觀察，通過抗酸染色對可能造成組織發(fā)黃的脂褐素顆粒進(jìn)行判定，并對其在細(xì)胞中存在的形態(tài)及位置進(jìn)行分析。

巴沙魚肝臟的病理改變

■ 白肉組肝臟HE染色

■ 黃肉組肝臟HE染色

HE染色結(jié)果表明白肉組肝細(xì)胞排列整齊。胞漿內(nèi)見有少量的棕黃色色素顆粒，多呈微細(xì)小顆粒狀。黃肉組肝臟形成較多空腔。肝細(xì)胞胞漿及部分腔狀結(jié)構(gòu)中見數(shù)量較多、團(tuán)塊狀的黃褐色物質(zhì)沉積。

■ 黃肉組肝臟抗酸染色(a)

■ 黃肉組肝臟抗酸染色(b)

在抗酸染色下，巴沙魚黃肉組織中的棕黃色顆粒被特異地染成了紅色，證實黃褐色顆粒為脂褐素。在肝臟組織中存在兩種脂褐素顆粒，一種為團(tuán)塊狀大顆粒，抗酸染色呈現(xiàn)為特殊的紅色。它們可分散存在于肝組織中（a），也可聚集存成團(tuán)（b）。另一種是小顆粒的脂褐素，它們廣泛的分布密布于肝臟的細(xì)胞核內(nèi)與胞漿中。

巴沙魚脂肪的病理改變

■ 白肉組脂肪HE染色

■ 黃肉組脂肪HE染色

白肉組巴沙魚的脂肪細(xì)胞大小較均一。黃肉組的脂肪細(xì)胞大小差異較大，同一放大倍數(shù)視野下的脂肪細(xì)胞數(shù)量顯著減少，因部分脂肪細(xì)胞體積顯著增大，胞漿內(nèi)沉積的脂肪顯著增多。黃肉組脂肪細(xì)胞膜附近有黃色顆粒存在，抗酸染色證實為脂褐素。脂褐素顆粒在黃肉組脂肪中以中等大小顆粒存在。脂褐素顆粒主要存在于脂肪細(xì)胞膜的交界處。

■ 黃肉組脂肪抗酸染色

■ 黃肉組脂肪抗酸染色

巴沙魚肌肉的病理改變

■ 白肉組肌肉HE染色

■ 黃肉組肌肉HE染色

白肉組骨骼肌肌漿內(nèi)有少量黃褐色顆粒狀物質(zhì)沉積，有沿橫紋方向平行排列的趨勢。黃肉組與白肉組的魚比較，黃脂組的肌漿內(nèi)沉積的黃褐色顆粒狀物質(zhì)的數(shù)量明顯激增。特殊染色證實黃褐色顆粒為脂褐素。在黃肉組肌肉組織中，脂褐素以細(xì)微顆粒的形式密布于肌肉纖維上，在細(xì)胞核附近的脂褐素顆粒略大。

■ 黃肉組肌肉抗酸染色

討論

1.導(dǎo)致組織變黃的物質(zhì)

從發(fā)黃巴沙魚的組織切片上我們可以看到大量的黃色團(tuán)塊和顆粒，正是這些黃色物質(zhì)導(dǎo)致巴沙魚的組織呈現(xiàn)出異常的黃色。通過抗酸染色，我們可以獲知這些黃色團(tuán)塊和顆粒正是脂褐素。脂褐素呈黃綠色發(fā)光顆粒，在3650-3660A有最大熒光吸收。脂褐素不溶于水，乙醇，脂肪溶劑，以及稀酸、稀堿溶液。脂褐素是細(xì)胞在自由基攻擊損傷后留下的遺跡。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞遭受體內(nèi)氧自由基攻擊時，由磷脂雙分子層構(gòu)成的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上的不飽和脂肪酸就被氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞的損傷。細(xì)胞中的溶酶體可通過自噬作用去消除這些損傷的區(qū)域，而未被完全消化的氧化脂肪殘存物及其它殘渣沉積形成了脂褐素。如果將體內(nèi)氧化的過程形象的描述為細(xì)胞內(nèi)的火焰，那么脂褐素就是這些火焰燃燒后留在組織內(nèi)的灰燼。隨著體內(nèi)氧化的不斷發(fā)生，脂褐素的不斷堆積最終導(dǎo)致組織顏色發(fā)黃。

在研究中我們發(fā)現(xiàn)，即使是表現(xiàn)為白肉的巴沙魚的組織切片，也可以找到脂褐素的蹤跡，只是相對于黃肉組，白肉組的脂褐素顆粒更小，數(shù)量也很少。所以黃肉是脂褐素堆積到能被肉眼識別時的一種狀態(tài)。在這之前脂褐素已經(jīng)產(chǎn)生并且可以探測，從而為我們在生產(chǎn)上控制黃肉的發(fā)生提供了有效的防控策略。

2.脂褐素的產(chǎn)生原因

正如Casselman原理所闡述的，當(dāng)組織中含有不飽和脂肪酸，而這個區(qū)域的體內(nèi)抗氧化物質(zhì)又相對不足時，脂肪的自動氧化就會發(fā)生，脂褐素就會形成。不飽和脂肪酸是產(chǎn)生脂褐素的底物，越多的不飽和脂肪酸則意味著需要越多的體內(nèi)抗氧化物質(zhì)去穩(wěn)定。魚類相對于其它動物是最富含不飽和脂肪的動物，因此也是最易于形成脂褐素的動物。

自由基是生命能量代謝的副產(chǎn)物，只要有ATP的生成就有自由基的生成。由于ATP產(chǎn)生于每個細(xì)胞中的線粒體中，因此自由基也就隨時產(chǎn)生于機(jī)體每一個細(xì)胞中。研究表明，動物每天呼吸的氧氣有2%的量會通過線粒體的呼吸鏈過程轉(zhuǎn)變?yōu)檠踝杂苫?。因此越快的生長速度就會產(chǎn)生越多的自由基產(chǎn)生量，并需要更多體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的消耗。

Wood等（1955）認(rèn)為，當(dāng)生理代謝上調(diào)時，一定組織區(qū)域內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運中斷或酶代謝異常都會導(dǎo)致局部區(qū)域的抗氧化物質(zhì)缺乏。巴沙魚是一種極耐低氧且快速生長的淡水魚類。由于這種特性，生產(chǎn)上往往采用極高密度的養(yǎng)殖，因此極易出現(xiàn)環(huán)境低氧和巴沙魚的缺氧。已知細(xì)胞內(nèi)存在兩套抗氧化系統(tǒng)，一套是以谷胱甘肽過氧化物酶，SOD酶為核心的抗氧化酶系統(tǒng)；另一套是以VC、VE、類胡蘿卜素等食源抗氧化物為核心的抗氧化物系統(tǒng)。由于酶的產(chǎn)生高度依賴機(jī)體的生理狀態(tài)，因此當(dāng)機(jī)體缺氧或者營養(yǎng)缺乏時就會導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)的低效運行。

在巴沙魚黃肉癥的綜合控制方案中，換水是控制巴沙魚黃肉率最為有效的途徑。已知水體溶氧的70-80%是通過被稱之為“水呼吸”的過程所消耗的。水呼吸的強(qiáng)度與水體微生物的豐度程度以及水體有機(jī)質(zhì)濃度高度相關(guān)。而控制水呼吸最有效的途徑就是換水。

3.發(fā)黃組織

在豬上脂褐素主要產(chǎn)生在脂肪組織，并引起豬膘發(fā)黃，俗稱“黃膘豬”。而在巴沙魚上發(fā)黃的不止有脂肪組織還有肌肉組織，俗稱“黃肉魚”。這種差異可能是由于以下幾種原因造成的。1.魚類肌肉細(xì)胞相對于豬含有更多的不飽和脂肪酸，因此當(dāng)魚類肌肉細(xì)胞中大量存在的不飽和脂肪氧化了，形成的脂褐素就導(dǎo)致肌肉變黃了。

另一種可能性是，由于巴沙魚肌肉是白色的，更容易呈現(xiàn)出黃色的脂褐素顏色。而豬的肌肉是紅色的，因此紅色掩蓋了黃色，從而導(dǎo)致人們忽略了豬肉色澤的改變。顏色掩蓋是極有可能發(fā)生的。我們在試驗時發(fā)現(xiàn)，脂褐素堆積最多、顆粒最大的是肝臟，而這些魚的肝臟并未呈現(xiàn)出黃色，而是比一般正常魚的肝臟顏色略微深一些，顏色發(fā)暗。

4.組織發(fā)黃的順序

在生產(chǎn)實踐中，人們觀察到黃肉巴沙魚最先發(fā)黃的區(qū)域是腹腔中的脂肪，然后是富含脂肪的腹部肌肉，最后再擴(kuò)散到全身肌肉。我們在進(jìn)行各組織脂褐素檢測時發(fā)現(xiàn)：脂褐素顆粒最大的是肝臟，然后是脂肪組織，最小的顆粒存在于肌肉。由于肝臟是動物體代謝最旺盛且擔(dān)負(fù)解毒的器官，因此脂褐素很有可能最先出現(xiàn)于肝臟，只是由于肝臟本身顏色的掩蓋導(dǎo)致脂褐素的沉積未被關(guān)注。

我們在使用氧化米糠飼喂巴沙魚的研究中確實發(fā)現(xiàn)，隨著氧化米糠添加量的增加，巴沙魚肝臟逐漸變深、變暗，而這時魚片的顏色只是呈現(xiàn)出淡淡的黃色。同時我們還發(fā)現(xiàn)，肝臟中除了形成大顆粒的脂褐素外，還密布大量的微顆粒脂褐素。大顆粒脂褐素可能是肝臟細(xì)胞膜氧化導(dǎo)致整個細(xì)胞壞死形成的，我們可以看到在肝臟的壞死區(qū)域存在大量脂褐素團(tuán)塊堆積。同時大量的干細(xì)胞壞死形成了肝組織的空腔，而脂褐素顆粒則存在于這些空腔中。這是細(xì)胞氧化燃燒后的灰燼。這與Wood等發(fā)現(xiàn)魚類肝臟中脂褐素普遍存在于肝臟壞死的區(qū)域（1955）的發(fā)現(xiàn)相一致。而微顆粒脂褐素主要存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，這可能是肝細(xì)胞中細(xì)胞器氧化損傷形成的。

已知除了細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層構(gòu)成的，細(xì)胞中的大量細(xì)胞器膜，如高爾基體、線粒體等的膜也是有磷脂雙分子層構(gòu)成的，這些膜上都存在大量的不飽和脂肪酸，都需要大量的體內(nèi)抗氧化物去穩(wěn)定。因此，細(xì)胞核與胞質(zhì)中微小的脂褐素顆粒，代表這些細(xì)胞經(jīng)歷了自由基的攻擊并保持了相對完整的結(jié)構(gòu)和功能。

5.控制脂褐素的生成

通過我們的調(diào)查，其實肌肉或脂肪發(fā)黃的不僅限于巴沙魚，斑點叉尾鮰是一直以背部肌肉發(fā)黃為詬病的養(yǎng)殖品種。此外，蛙、海鱸、加州鱸以及石斑魚在市場上都時有脂肪發(fā)黃或肌肉發(fā)黃的案例發(fā)生。高能飼料、高頻投喂、高密度飼養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖必然的結(jié)果是魚體內(nèi)更多的自由基產(chǎn)生。而魚類細(xì)胞中高含量的多不飽和脂肪酸是一個隨時等待點燃的“炸藥包”，因此當(dāng)任何飼料或養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的欠缺就會導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。

諾偉司是飼料抗氧化劑乙氧基喹啉的發(fā)明者，我們深諳現(xiàn)代高產(chǎn)動物的諸多問題都是由于高速生長引起的自由基損傷導(dǎo)致的，因此開創(chuàng)性的發(fā)明了專業(yè)的體內(nèi)抗氧化劑—愛克多?PLUS。通過在飼料中添加專業(yè)的體內(nèi)抗氧化劑愛克多?PLUS，可以有效消除水生動物體內(nèi)自由基，從而達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞的作用。愛克多?PLUS目前已成為穩(wěn)定魚體肉色和體色的標(biāo)準(zhǔn)添加劑。

結(jié)論：

通過對典型發(fā)黃巴沙魚的肝臟、脂肪以及肌肉的切片分析，我們首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致巴沙魚魚片發(fā)黃的原因是體內(nèi)氧化形成的脂褐素。脂褐素沉積的先后規(guī)律是肝臟組織、脂肪組織、肌肉組織。提示我們可通過對肝臟脂褐素的監(jiān)控實現(xiàn)生產(chǎn)中對黃肉發(fā)生的預(yù)警。體內(nèi)氧化應(yīng)激是導(dǎo)致脂褐素生成的原因。避免體內(nèi)氧化應(yīng)激是控制脂褐素生成的唯一手段。全程添加專業(yè)的體內(nèi)抗氧化劑—愛克多?PLUS被生產(chǎn)實踐證實對于預(yù)防和消除黃肉發(fā)生具有重要的實踐意義。

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