黑斑蛙變態(tài)過程中甲狀腺發(fā)育及甲狀腺激素分泌

黑斑蛙變態(tài)過程中甲狀腺發(fā)育及甲狀腺激素分泌

葛雅楠1,2李圓圓1張銀鳳1樓欽欽1趙亞嫻1秦占芬1

(1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085; 2. 福建農(nóng)林大學(xué), 福州 350002)

系統(tǒng)研究了我國本土兩棲動(dòng)物種黑斑蛙(Rana nigromaculata)變態(tài)發(fā)育過程中甲狀腺組織學(xué)和甲狀腺激素水平的變化, 為甲狀腺生物學(xué)和甲狀腺干擾研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。黑斑蛙蝌蚪發(fā)育的形態(tài)變化: 第26—40階段, 后腿芽生長并逐漸分化出五趾結(jié)構(gòu); 42階段, 開始進(jìn)入變態(tài)高峰期, 前肢展開, 尾吸收, 蝌蚪身體發(fā)生巨大形變; 46階段, 蝌蚪完全變態(tài)成小蛙。隨著形態(tài)學(xué)的變化, 甲狀腺的組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯的變化: 26—37階段, 甲狀腺體積較小, 增長緩慢; 38階段甲狀腺體積迅速膨大, 進(jìn)入高峰期, 甲狀腺的發(fā)育達(dá)到頂峰; 隨著變態(tài)完成, 甲狀腺又逐漸縮小。甲狀腺組織學(xué)變化的同時(shí), 甲狀腺激素水平也相應(yīng)發(fā)生變化: 在變態(tài)前期, 下頜中3,3’,5-三碘代-L-甲腺原氨酸(T3)水平增長緩慢, 進(jìn)入變態(tài)期后, T3含量迅速升高, 在變態(tài)高峰期達(dá)到峰值, 隨后下降。以上結(jié)果表明, 黑斑蛙發(fā)育過程中甲狀腺組織學(xué)的變化與甲狀腺激素水平的波動(dòng)相吻合。對(duì)黑斑蛙甲狀腺系統(tǒng)的研究, 可為日后使用黑斑蛙開展甲狀腺干擾作用的研究提供基礎(chǔ)。

黑斑蛙; 蝌蚪; 甲狀腺; 甲狀腺激素; 發(fā)育

兩棲動(dòng)物的變態(tài)發(fā)育過程受甲狀腺激素調(diào)控,因此兩棲動(dòng)物一直被認(rèn)為是研究甲狀腺激素功能和信號(hào)通路的模式生物[1,2]。隨著人們對(duì)環(huán)境污染物甲狀腺干擾作用的日趨關(guān)注[3,4], 許多兩棲動(dòng)物種被用于甲狀腺干擾的研究[5—8], 如國際通用種非洲爪蟾[9,10]、加拿大的牛蛙和豹蛙[11,12]、歐洲的林蛙[13,14]、日本的粗皮蛙[15,16]等。鑒于目前從國外進(jìn)口非洲爪蟾存在一些問題, 開展我國本土兩棲動(dòng)物種的研究意義重大, 以期為甲狀腺干擾及其他領(lǐng)域的研究提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

黑斑蛙(Rana nigromaculata)是我國常見的一個(gè)兩棲動(dòng)物種, 部分學(xué)者對(duì)黑斑蛙的生物學(xué)[17—20]和毒理學(xué)[21,22]有過一定研究。然而目前還沒有關(guān)于黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中甲狀腺發(fā)育和甲狀腺激素分泌的報(bào)道, 也沒有黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中形態(tài)的描述。這些信息是開展黑斑蛙甲狀腺干擾研究的生物學(xué)基礎(chǔ)。本文系統(tǒng)研究了黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中整體形態(tài)、甲狀腺組織學(xué)以及甲狀腺激素水平的變化,以推進(jìn)黑斑蛙在甲狀腺干擾研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 黑斑蛙和蝌蚪的飼養(yǎng)

黑斑蛙成蛙飼養(yǎng)在動(dòng)物房水陸兩棲的玻璃缸中,每天清洗, 水溫(23±2) , ℃ 明暗光周期為12h 12h∶ 。成蛙每天喂食添加胡蘿卜的面包蟲1次。成年雌蛙雄蛙各注射15 μg 促黃體素釋放激素A3(LHRH-A3)和人絨毛膜促性腺激素[雌蛙 300國際單位(IU), 雄蛙 200 IU], 兩種激素均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.6%的生理鹽水配制, 放入兩棲動(dòng)物誘導(dǎo)繁育設(shè)備中, 誘導(dǎo)其抱對(duì)產(chǎn)卵。

受精卵放入去氯水中孵化, 4d后孵化成蝌蚪。將蝌蚪轉(zhuǎn)移至蝌蚪缸中(100 cm×60 cm×30 cm) 飼養(yǎng), 水深15 cm, 每天喂食飼料(購自香港)兩次。每缸的蝌蚪密度每升水中不多于 5只蝌蚪(Gosner 30階段[23]之前), 30階段之后每升水不多于1.5只蝌蚪。蝌蚪飼養(yǎng)缸每周換水兩次, 水的條件控制如下: 無氯, pH 6.5—7.0, 溶解氧大于 5 mg/L, 硬度(CaCO3)約150 mg/L。在兩棲動(dòng)物房中, 溫度 (23±2)℃、明暗光周期為 12h 12h∶ (蝌蚪缸水面光強(qiáng)在 600—1000 μmol/(m2·s), 成蛙缸光強(qiáng)在100—300 μmol/(m2·s),待蝌蚪發(fā)育至Gosner 26—46階段[23]取樣。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察和階段識(shí)別

按照Gosner[23]對(duì)無尾目蝌蚪的階段劃分系統(tǒng)對(duì)黑斑蛙蝌蚪發(fā)育階段進(jìn)行劃分。取26—46各階段蝌蚪麻醉后固定于固定液[固定液配方為苦味酸︰甲醛︰冰醋酸(體積比)=75︰25︰5]中, 直接肉眼觀察其形態(tài), 其四肢置于體式顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)為 1—4倍)。每個(gè)階段蝌蚪進(jìn)行照相,并重點(diǎn)觀察腿部變化。根據(jù)蝌蚪階段, 對(duì)其形態(tài)學(xué)特征加以觀察描述。

1.3 甲狀腺組織學(xué)檢查

將 26—46各階段蝌蚪麻醉后, 取下頜放入固定液中,每個(gè)階段至少取三只下頜。將組織從固定液內(nèi)取出后, 沖水24h; 經(jīng)過70%、80%、95%及100%酒精濃度梯度脫水后,放入85%、95%及100%二甲苯中透明。經(jīng)過浸蠟、包埋后進(jìn)行切片。切片厚度5 μm, 然后經(jīng)過脫蠟、HE染色、封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照,放大倍數(shù)為 10×目鏡, 10×物鏡。對(duì)最大截面進(jìn)行分析, 觀察濾泡、濾泡細(xì)胞及膠質(zhì)形態(tài)、顏色、大小等。

1.4 甲狀腺激素提取及測定

將黑斑蛙32/33—46各段蝌蚪下頜取出后, 放入1.5 mL無水乙醇內(nèi), 剪碎后加入1顆氧化鋯珠子。在勻漿儀中研磨2min。置于超聲儀中超聲30s,然后離心15min, 吸取上清液。在沉淀中加入 0.3 mL冰無水乙醇, 超聲30s后, 離心5min,合并上清。將兩次上清液在37℃水浴中蒸干, 加入0.5 mL PBS緩沖液, 充分溶解后, 用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)測定T3含量。

圖 1 黑斑蛙蝌蚪各階段形態(tài)學(xué)特征Fig. 1 Morphological features of tadpoles at stage 26—46

2 結(jié)果

2.1 黑斑蛙蝌蚪各階段形態(tài)學(xué)變化

黑斑蛙蝌蚪 26—46各階段的形態(tài)學(xué)變化如下(圖1): 26—30階段主要特征為后肢的生長, 稱為后肢芽發(fā)育期: 26階段為后肢芽剛剛出現(xiàn), 長度不足寬度的一半; 27階段的后腿芽長度超過寬度的一半但小于寬度; 28階段時(shí)后腿芽長度略超過寬度; 29/30階段, 后肢芽長度可達(dá)寬度的 1.5—2倍。31—36階段, 為趾分化期: 31階段時(shí), 后肢芽呈槳狀; 32/33階段, 后肢出現(xiàn)兩個(gè)缺凹; 34、35階段, 缺凹增加為三個(gè)和四個(gè); 到達(dá)36階段時(shí), 前三個(gè)缺凹加深, 分化出三趾; 37階段時(shí)四個(gè)缺凹都加深, 分化出明顯的五趾。38—40階段出現(xiàn)蹼突和關(guān)節(jié)下瘤, 38階段, 第一趾基出現(xiàn)蹼突; 到了40階段, 五趾腹面均出現(xiàn)關(guān)節(jié)下瘤。40階段后蝌蚪發(fā)育進(jìn)入變態(tài)期,更加劇烈的形變開始。41階段, 穿于前肢外的皮膚變透明, 泄殖腔褶消失或幾近消失; 42階段, 前肢展開, 從這一階段開始, 口角開始逐漸變寬。43階段口裂加深, 從側(cè)面看口角超過鼻孔, 但未達(dá)到眼,同時(shí)鰓和尾開始吸收。44階段口裂進(jìn)一步加深, 口角達(dá)到眼中部水平, 鰓完全吸收。45階段口角達(dá)到眼后水平, 尾萎縮吸收而趨于消失, 只余一個(gè)小突起。46階段尾完全吸收, 四肢發(fā)達(dá), 基本具備與成體相似的色斑, 意味著整個(gè)變態(tài)過程完成。

圖 2 黑斑蛙26—46階段甲狀腺組織學(xué)切片F(xiàn)ig. 2 Histological features of thyroid gland at stage 26—46

2.2 黑斑蛙蝌蚪各階段甲狀腺組織學(xué)變化

如圖2所示, 在蝌蚪的第一個(gè)階段(26階段), 甲狀腺體積很小, 但已經(jīng)有濾泡存在, 在最大截面處可以看到由單層上皮細(xì)胞組成的 1—2個(gè)濾泡結(jié)構(gòu),中間有膠質(zhì)存在。在隨后的變態(tài)發(fā)育過程中, 在27—37階段時(shí), 甲狀腺體積緩慢增大, 濾泡個(gè)數(shù)逐漸增多, 濾泡體積也在不斷增大, 與此同時(shí), 濾泡內(nèi)膠質(zhì)含量也在緩慢增加。到38階段, 甲狀腺體積突然膨大, 濾泡數(shù)目也迅速增大, 濾泡內(nèi)的膠質(zhì)明顯增多, 膠質(zhì)面積相應(yīng)增加。接下來的39—41階段,甲狀腺體積、濾泡數(shù)目、膠質(zhì)面積繼續(xù)增加。42階段甲狀腺體積、濾泡數(shù)目、膠質(zhì)面積急劇增加, 至43階段甲狀腺發(fā)育達(dá)到頂峰, 表現(xiàn)為甲狀腺體積最大、濾泡數(shù)目最多、膠質(zhì)面積最大。之后的44—46階段, 甲狀腺逐漸縮小, 濾泡數(shù)目減少、膠質(zhì)面積減少, 濾泡形狀變得不規(guī)則。

圖3 32—46階段黑斑蛙蝌蚪下頜中T3含量Fig. 3 T3 content in each lower jaw at stage of 32—46

2.3 黑斑蛙發(fā)育過程中T3激素水平變化

黑斑蛙發(fā)育過程下頜中T3的水平如圖3所示,整體變化趨勢是: 在變態(tài)前的發(fā)育階段中, T3含量增長緩慢, 進(jìn)入變態(tài)期后, T3含量迅速升高, 在變態(tài)高峰期達(dá)到峰值, 隨后慢慢下降。具體而言, 在32/33階段, 黑斑蛙的下頜中已經(jīng)可以檢測出 T3,每個(gè)下頜中含量大約是34 pg。在34—41階段, 下頜中T3含量增長緩慢, 每只下頜中T3含量從34 pg增加到45 pg左右。從42階段開始, 下頜中T3含量迅速上升, 每只下頜中T3含量超過110 pg。在43階段, T3含量達(dá)到最高峰, 每只下頜中T3的峰值水平在130 pg左右。44階段甲狀腺激素合成開始減少,使甲狀腺內(nèi)T3激素水平逐漸回落。變態(tài)完成后(46階段), 下頜中T3含量維持在一定水平。

3 討論

Gosner建立的胚胎和蝌蚪發(fā)育階段的劃分系統(tǒng)被廣泛用于無尾目動(dòng)物發(fā)育階段的識(shí)別。本文按照Gosner的系統(tǒng), 對(duì)黑斑蛙發(fā)育過程中的形態(tài)變化進(jìn)行了系統(tǒng)描述。整體來看, 黑斑蛙的形態(tài)變化與Gosner系統(tǒng)中的形態(tài)描述基本一致, 除了兩處細(xì)微不同: Gosner將后腿芽長度為寬度的1.5倍至2倍定義為 29階段; 當(dāng)長度達(dá)到寬度的 2倍, 定義為 30階段; 后腿芽出現(xiàn)槳狀足, 定義為31階段。但是我們觀察黑斑蛙發(fā)現(xiàn), 后腿芽的長一般到不了寬的 2倍時(shí)就會(huì)出現(xiàn)槳狀足, 也就是30階段不明顯, 所以我們將黑斑蛙的29/30階段合并。另外, Gosner定義32和33階段分別為槳狀足上出現(xiàn)1個(gè)和2個(gè)缺凹;而黑斑蛙中 2個(gè)缺凹幾乎同時(shí)出現(xiàn), 所以我們也將32/33合并。

兩棲動(dòng)物的變態(tài)發(fā)育主要依賴于甲狀腺分泌的甲狀腺激素。本文研究了黑斑蛙從蝌蚪第一個(gè)階段到最后一個(gè)階段期間甲狀腺的發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 黑斑蛙在蝌蚪的第一個(gè)階段即 26階段就出現(xiàn)包含膠質(zhì)的甲狀腺濾泡。之前的文獻(xiàn)顯示, 非洲爪蟾的甲狀腺濾泡在Nieuwkoop and Faber (NF)階段劃分系統(tǒng)的49—50階段才開始出現(xiàn), 到51階段時(shí)包含膠質(zhì)的濾泡真正形成[24]。由此看來, 黑斑蛙的甲狀腺濾泡出現(xiàn)時(shí)間比非洲爪蟾要早。從激素分泌的時(shí)間來看, 我們?cè)?2/33階段的黑斑蛙下頜中檢出了T3的存在。而早期文獻(xiàn)認(rèn)為, 非洲爪蟾在NF 54階段時(shí)甲狀腺才開始合成分泌甲狀腺激素[24]。但近期的研究認(rèn)為, 早期非洲爪蟾蝌蚪的甲狀腺也具有合成甲狀腺激素的功能, 作者分析早期研究之所以報(bào)道非洲爪蟾甲狀腺在 NF54才開始分泌激素, 可能是因?yàn)楫?dāng)時(shí)的檢測方法不夠靈敏所致[25]。與非洲爪蟾NF54階段對(duì)應(yīng)的黑斑蛙階段為 34階段, 但是這個(gè)階段 T3水平與前一個(gè)階段相比沒有明顯的升高趨勢, 雖然34階段的甲狀腺明顯比32/33階段的甲狀腺大, 甲狀腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)也明顯發(fā)達(dá)。到38階段時(shí)黑斑蛙的甲狀腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)又有一次較為明顯的發(fā)育, 表現(xiàn)為體積增加和濾泡數(shù)目增加, 相應(yīng)甲狀腺組織的發(fā)育, T3的水平也呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。對(duì)應(yīng)甲狀腺的進(jìn)一步發(fā)育, T3水平在40階段和41階段明顯上升。42階段時(shí)甲狀腺濾泡迅速增至 20個(gè)左右, T3水平隨之劇烈升高。到43階段T3水平達(dá)到頂峰, 此時(shí)的甲狀腺組織結(jié)構(gòu)最為發(fā)達(dá), 濾泡數(shù)目多達(dá) 30個(gè)以上。44階段時(shí)甲狀腺開始退化, 相應(yīng)T3水平回落。之后45階段和46階段, 甲狀腺繼續(xù)退化, 相應(yīng)T3水平迅速回落。從整個(gè)發(fā)育過程來看,黑斑蛙甲狀腺激素水平的變化與甲狀腺組織學(xué)的變化是一致的。

根據(jù)甲狀腺激素的開始分泌、水平升高、回落以及對(duì)應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化, 一般將兩棲動(dòng)物的變態(tài)分為三個(gè)時(shí)期: 甲狀腺激素不分泌或極少量分泌的預(yù)變態(tài)期(Pre-metamorphosis), 對(duì)應(yīng)腿芽的發(fā)生和生長; 甲狀腺激素分泌但仍保持一個(gè)低水平狀態(tài)的前變態(tài)期(Pro-metamorphosis), 對(duì)應(yīng)趾的分化和腿的快速發(fā)育; 甲狀腺激素水平升高直至變態(tài)完成的變態(tài)高峰期(Metamorphic climax), 對(duì)應(yīng)鰓和尾的吸收、腸的重塑等劇烈的變化。從激素水平的研究數(shù)據(jù)來看, 黑斑蛙發(fā)育過程中并沒有一個(gè)T3從無到有的階段, 在34階段附近也沒有一個(gè)甲狀腺明顯上升的拐點(diǎn), 所以我們不能根據(jù)甲狀腺激素的變化來確定預(yù)變態(tài)期和前變態(tài)期的界限。但為了研究過程中可與其他兩棲物種尤其與非洲爪蟾比較, 我們參考非洲爪蟾54階段作為前變態(tài)期的第一個(gè)階段, 將與后腿發(fā)育與之對(duì)應(yīng)的黑斑蛙的 34階段作為前變態(tài)期的第一個(gè)階段。在42階段, 黑斑蛙的T3水平急劇升高, 相應(yīng)的形態(tài)發(fā)生劇烈的變化, 如前腿展開、口角變寬、鰓開始吸收等, 可視作變態(tài)高峰期的開始。因此, 黑斑蛙變態(tài)的三個(gè)時(shí)期可作如下劃分: 預(yù)變態(tài)期為26—33階段, 前變態(tài)期為34—41階段, 變態(tài)高峰期為42—46階段。

綜合以上工作, 本文較為系統(tǒng)地研究了黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中整體形態(tài)變化, 繪制了甲狀腺組織學(xué)發(fā)育圖譜, 描述了甲狀腺激素水平的變化, 為今后黑斑蛙甲狀腺激素功能和甲狀腺干擾研究奠定基礎(chǔ)。

[1] Yen P M. Physiological and molecular basis of thyroid hormone action [J]. Physiological Reviews, 2001, 81(3):1097—1142

[2] Bernal J, Guada?o-Ferraz A, Morte B. Perspectives in the study of thyroid hormone action on brain development and function [J]. Thyroid, 2003, 13(11): 1005—1012

[3] Brucker-Davis F. Effects of environmental synthetic chemicals on thyroid function [J]. Thyroid, 1998, 8(9): 827—856

[4] Zoeller R T. Environmental chemicals impacting the thyroid: targets and consequences [J]. Thyroid, 2007, 17(9): 811—817

[5] Tata J R. Amphibian metamorphosis as a model for the developmental actions of thyroid hormone [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2006, 246(1): 10—20

[6] Heimeier R A, Das B, Buchholz D R, et al. Studies on Xenopus laevis intestine reveal biological pathways underlying vertebrate gut adaptation from embryo to adult [J]. Genome Biology, 2010, 11(5): k55

[7] Das B, Matsuda H, Fujimoto K, et al. Molecular and genetic studies suggest that thyroid hormone receptor is both necessary and sufficient to mediate the developmental effects of thyroid hormone [J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 168(2): 174—180

[8] Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 [S]. Paris: OECD, 2009

[9] Degitz S J, Holcombe G W, Flynn K M, et al. Progress towards development of an amphibian-based thyroid screening assay using Xenopus laevis Organismal and thyroidal responses to the model compounds 6-propylthiouracil, methimazole, and thyroxine [J]. Toxicological Sciences, 2005, 87(2): 353—364

[10] Heimeier R A, Das B, Buchholz D R, et al. The xenoestrogen bisphenol A inhibits postembryonic vertebrate development by antagonizing gene regulation by thyroid hormone [J]. Endocrinology, 2009, 150(6): 2964—2973

[11] Helbing C C, Ovaska K, Ji L. Evaluation of the effect of acetochlor on thyroid hormone receptor gene expression in the brain and behavior of Rana catesbeiana tadpoles [J]. Aquatic Toxicology, 2006, 80(1): 42—51

[12] Croteau M C, Davidson M, Duarte-Guterman P, et al. Assessment of thyroid system disruption in Rana pipiens tadpoles chronically exposed to UVB radiation and 4-tert-octylphenol [J]. Aquatic Toxicology, 2009, 95(2): 81—92

[13] Arukwe A, Jenssen B M. Differential organ expression patterns of thyroid hormone receptor isoform genes in p, p′-DDE-treated adult male common frog, Rana temporaria [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005, 20(3): 485—492

[14] Gutleb A C, Appelman J, Bronkhorst M, et al. Effects of oral exposure to polychlorinated biphenyls (PCBs) on the development and metamorphosis of two amphibian species (Xenopus laevis and Rana temporaria ) [J]. Science of the Total Environment, 2000, 262(1): 147—157

[15] Hanada H, Katsu K, Kanno T, et al. Cyclosporin A inhibits thyroid hormone-induced shortening of the tadpole tail through membrane permeability transition [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 135(3): 473—483

[16] Oka T, Miyahara M, Yamamoto J, et al. Application of metamorphosis assay to a native Japanese amphibian species, Rana rugosa, for assessing effects of thyroid system affecting chemicals [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72(5): 1400—1405

[17] Park S, Park S H, Ahn H C, et al. Structural study of novel antimicrobial peptides, nigrocins, isolated from Rana nigromaculata [J]. FEBS Letters, 2001, 507(1): 95—100

[18] Sumida M, Kanamori Y, Kaneda H, et al. Complete nucleotide sequence and gene rearrangement of the mitochondrial genome of the Japanese pond frog Rana nigromaculata [J]. Genes & Genetic Systems, 2001, 76(5): 311—325

[19] Sumida M, Kato Y, Kurabayashi A. Sequencing and analysis of the internal transcribed spacers (ITSs) and coding regions in the EcoR I fragment of the ribosomal DNA of the Japanese pond frog Rana nigromaculata [J]. Genes & Genetic Systems, 2004, 79(2): 105—118

[20] Takase M, Ukena K, Tsutsui K. Expression and localization of cytochrome P45011β, aldo mRNA in the frog brain [J]. Brain Research, 2002, 950(1): 288—296

[21] Li X Y, Zhou J, Yu M, et al. Toxic effects of 1-methyl-3-octylimidazolium bromide on the early embryonic development of the frog Rana nigromaculata [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72(2): 552—556

[22] Wang M Z, Jia X Y. Low levels of lead exposure induce oxidative damage and DNA damage in the testes of the frog Rana nigromaculata [J]. Ecotoxicology, 2009, 18(1): 94—99

[23] Gosner K L. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification [J]. Herpetologica, 1960, 16(3): 183—190

[24] Nieuwkoop P D, Faber J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis [M]. Garland Publishing Inc. 1956, 22

[25] Marsh-Armstrong N, Cai L, Brown D D. Thyroid hormone controls the development of connections between the spinal cord and limbs during Xenopus laevis metamorphosis [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004, 101(1): 165—170